Dados do Trabalho

Título

Desenvolvimento de Reação em Cadeia da Polimerase com curva de dissociação de alta resolução (PCR-HRM) para detecção e diferenciação dos sorotipos de Dengue circulantes no país.

Introdução

O vírus Dengue (DENV) apresenta genoma constituído por uma molécula de RNA fita simples, envelopado e com polaridade positiva. Rotineiramente, a ferramenta padrão utilizada para sorotipagem de DENV é baseada na utilização de sondas fluorescentes. Entretanto, o avanço nas técnicas moleculares e a popularização da metodologia de High Resolution Melting, a partir da utilização de intercalantes de DNA de nova geração, como o EvaGreen dye, vem permitindo o desenvolvimento de protocolos mais econômicos, rápidos e sensíveis.

Objetivo (s)

Neste estudo, objetivamos estabelecer uma reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real associada à análise da curva de dissociação de alta resolução (High-Resolution Melting-HRM) como ferramenta de detecção e tipagem viral para DENV, a partir das diferentes temperaturas de melting identificadas para cada sorotipo. 

Material e Métodos

Foram utilizadas amostras isoladas a partir de soro de pacientes armazenadas no banco de amostras do Laboratório de Arbovírus e Vírus Hemorrágicos, IOC/FIOCRUZ. O estudo encontra-se dentro dos objetivos aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Fundação Oswaldo Cruz e as amostras utilizadas foram cadastradas no SisGen. Para a padronização do protocolo foram seguidas as RDC nº 665 de 30/03/2022 e a RDC nº 166, de 24 de julho de 2017. As amostras foram submetidas a extração do RNA viral, houve a determinação e síntese de primers específicos contendo as substituições de nucleotídeo único (SNPs) capazes de diferenciar os sorotipos e houve o estabelecimento das condições ótimas de ciclagem e HRM. O método foi parcialmente validado, a partir dos parâmetros de seletividade, exatidão e precisão.

Resultados e Conclusão

Foi estabelecido a Tm de 79.2°C para DENV-1, 82.3°C para DENV-2, 81.2°C para DENV-3, 80°C para DENV-4. Ficou demonstrado 100% de sensibilidade e especificidade. O desvio padrão relativo foi estabelecido em 4,4%, referente a precisão intermediária. A curva padrão obtida demonstrou um R² = 0,99 e um slope de -3,21, conferindo uma eficiência de reação de 104,9%. As análises de exatidão permaneceram dentro da faixa 70-120% de recuperação do analito e os coeficientes de variação ≤ 20%, conforme preconizado pelo SANCO. A estratégia utilizada permitiu o estabelecimento de um PCR-HRM que consiste em uma abordagem rápida, específica, de alto rendimento e mais econômica para protocolos de detecção e diferenciação de DENV e encontra-se em proteção intelectual (patente) depositada sob registro BR020230059201.

Palavras Chave

dengue; HRM; DENV; Arbovirus; PCR-HRM