Dados do Trabalho

Título

Caracterização bioquímica e purificação parcial de mureína endopeptidase em amostras intestinais de Rhodnius prolixus

Introdução

Rhodnius prolixus, vetor do Trypanosoma cruzi, agente da Doença de Chagas, mantém uma relação simbiótica com bactérias não patogênicas, fundamental em eventos fisiológicos. Análises genômicas do vetor identificaram o gene RPRC003168, possivelmente adquirido por transferência horizontal. Esse gene corresponde à mureína endopeptidase, uma metalopeptidase comum em bactérias gram-negativas, responsável por clivar a parede bacteriana. 

Objetivo (s)

Determinar a atividade enzimática após filtração, após ciclos de congelamento e descongelamento, após inibição por sais e inibidores; purificar a mureína endopeptidase em amostras intestinais de R. prolixus. 

Material e Métodos

Todos os ensaios foram realizados utilizando como amostra o intestino médio anterior de ninfas de quinto instar em diferentes dias após a alimentação. O órgão foi adicionado a 100uL de solução salina 0,9% (p/v), homogeneizado, centrifugado e o sobrenadante foi coletado. As amostras foram ensaiadas com Mycrococcus lysodeikticus 0,0015% (p/v). No ensaio de filtração foi adicionado 200uL de solução salina 0,9% (p/v) ao tecido. As amostras foram filtradas em filtro de 0,22 micrômetros. Para avaliar a inibição enzimática por sais foram adicionados NaCl, KCl e Na2SO4 em concentração final de 250mM. O ensaio com inibidores de protease foi realizado com os inibidores E64, pepstatina A, PMSF, fenantrolina em altas concentrações finais.  Para a purificação foi realizada uma Cromatografia em AKTA-FPLC de filtração em gel em coluna Superdex 75 10/300 GL. A amostra foi filtrada em filtro de 0,22 micrômetros. As frações foram ensaiadas com M. lysodeikticus 0,0015% (p/v). As frações com maior atividade foram quantificadas. Após, foi realizada a precipitação com TCA e aplicação em gel de poliacrilamida 12%. Experimentos realizados sob CEUA/IOC – 033/2018.

Resultados e Conclusão

A atividade enzimática após filtração permaneceu. Ademais, a atividade enzimática resistiu à inibição por sais ou inibidores de protease. Em gel de poliacrilamida, foi identificada uma proteína de peso molecular de 39KDa, semelhante à enzima de Escherichia coli e distinta das enzimas conhecidas de R. prolixus e das proteínas de coelho provenientes da alimentação. Foi possível esclarecer a etiologia da atividade enzimática através da filtração e descartar a participação em grande escala de outras classes de protease. A partir da purificação prévia foi possível identificar o peso molecular de uma enzima incomum, provavelmente mureína endopeptidase. 

Palavras Chave

bioquímica; enzimologia; mureína endopeptidase; purificação; Rhodnius prolixus