Dados do Trabalho

Título

Produção nacional e avaliação da proteína recombinante Lb6H para o diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar Americana

Introdução

No diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA), os aspectos clínico-epidemiológicos são fundamentais, porém são necessários exames laboratoriais para confirmar o diagnóstico, pois as manifestações clínicas não são patognomônicas. A interrupção da produção de leishmanina para o teste de hipersensibilidade tardia e a ausência de testes sorológicos de fácil acesso resultaram em uma lacuna na confirmação da doença, especialmente em áreas remotas com recursos limitados. No IDRI (atual AAHI), Seattle, EUA, o antígeno recombinante (r) Lb6H foi identificado durante a triagem de uma biblioteca de expressão genômica de L. (V.) braziliensis (MHOM/BR/75/M2903) empregando soro de paciente com leishmaniose mucosa, causada por L. braziliensis. Nosso grupo avaliou (2017) e validou (2022) o rLb6H em plataforma ELISA para diagnóstico de LTA, com resultados promissores. 

Objetivo (s)

O objetivo do estudo foi produzir a proteína rLb6H e prototipar kits sorológicos em plataforma ELISA empregando o antígeno de produção nacional para pesquisa de IgG anti-Leishmania para o diagnóstico da LTA.

Material e Métodos

A sequência da rLb6H foi otimizada e analisada por bioinformática. O vetor pET24a(+) contendo o gene Lb6H foi transformado em E. coli da linhagem SHuffle T7 Express. A indução foi realizada em diferentes tempos e temperaturas para avaliar a melhor condição de expressão proteica. A análise por SDS-PAGE mostrou que a proteína Lb6H apresentou uma banda de 76,2 kDa. Após a lise, o sedimento contendo a proteína Lb6H foi solubilizado em tampão com ureia 8 M e a proteína foi purificada por cromatografia de afinidade em coluna de histidina. Após diálise, a proteína foi quantificada utilizando um Ensaio de Proteína BCA (CAPPeq N° 5.195.089). 

Resultados e Conclusão

Dos três lotes produzidos, até o momento, o que apresentou melhores resultados no ELISA, forneceu sensibilidade (IC 95%) de 95,56% (89,1%-98,3%) e especificidade (IC 95%) de 96,39% (89,9%-99,0%), quando aplicado a 93 amostras de pacientes com LTA (exame direto e/ou PCR positivo) e 83 amostras de indivíduos saudáveis, respectivamente. Na avaliação da reprodutibilidade, homogeneidade e repetitividade obtiveram-se coeficientes de variação dentro dos parâmetros de qualidade. As placas sensibilizadas com rLb6H, permaneceram estáveis a 4°C e -20°C por 210 dias. Com base nos resultados iniciais, concluímos preliminarmente que o ELISA-rLb6H com proteína de produção nacional é promissor para, num futuro, complementar o diagnóstico da LTA.

Palavras Chave

Leishmaniose Tegumentar; diagnóstico; ELISA; rLb6H