Dados do Trabalho

Título

DESENVOLVIMENTO DE ELISA UTILIZANDO A PROTEÍNA DE SUPERFÍCIE DE AMASTIGOTA (ASP-2) PARA O DIAGNÓSTICO DA DOENÇA DE CHAGAS

Introdução

A doença de Chagas (DC) é uma doença negligenciada causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi. Ainda há barreiras no diagnóstico da fase crônica da DC devido a parasitemia reduzida ou nula e reação cruzada com outras doenças infecciosas. A proteína de superfície de amastigota (ASP) é uma proteína codificada por gene da família das trans-sialidases e identificada como promissora em estudos de vacinação para a infecção pelo T. cruzi. 

Objetivo (s)

O objetivo foi desenvolver dois ensaios ELISA utilizando anticorpos monoclonais anti-ASP-2 e o antígeno ASP-2, para a detecção de proteínas ASP-2 ou anticorpos anti-ASP-2 em amostras de soro. 

Material e Métodos

Este estudo foi aprovado pelo COPEP nº CAAE 39933520.1.0000.0104 e pela CEUA n° 2516181021. No ELISA sanduíche, microplacas de 96 poços foram sensibilizadas com anticorpo anti-ASP-2 (3 µg/mL) e incubado overnight a 4 °C. Após lavagem e bloqueio, as amostras (soro não diluído de pacientes com e sem DC; ou curva padrão de diluição de ASP-2; ou PBS-T como branco) foram incubadas por 1h. Foi utilizado anticorpo de detecção biotinilado anti-ASP-2 (3 µg/mL) e peroxidase (HRP, 1:10.000). Após, utilizou-se TMB, solução de ácido sulfúrico 2M e a leitura foi realizada em 450 nm em leitor de microplacas. No ELISA indireto, a sensibilização foi feita com ASP-2 (5 µg/mL) e a curva padrão com anticorpo anti-ASP-2. As demais etapas seguiram conforme descrito anteriormente. As amostras testadas foram soro de camundongos infectados com T. cruzi e não infectados (1/50). Foi utilizado anticorpo anti-IgG de camundongo conjugado com HRP (1:350). No valor de corte (cut-off) foi considerado a média da absorbância das amostras negativas acrescida de três desvios padrões. 

Resultados e Conclusão

No ELISA sanduíche o limite de detecção de ASP-2 na curva padrão foi 1,6 ng/mL. Entretanto, em relação as amostras de soro de pacientes, apenas uma amostra positiva excedeu o valor de corte. No ensaio ELISA indireto com amostras de camundongos, dez amostras positivas das treze testadas ultrapassaram o valor de corte para a detecção de anticorpos anti-ASP-2. A detecção de ASP-2 em soro de indivíduos infectados não se mostrou eficaz para o diagnóstico da DC. No entanto, o uso desta proteína para detectar anticorpos anti-amastigotas parece promissor. A próxima etapa deste estudo envolverá a testagem das amostras em maior diluição e, posteriormente, avaliaremos soros de pacientes. Esperamos que esse achado conduza ao desenvolvimento de um método diagnóstico eficaz e sensível para a doença de Chagas.  

Palavras Chave

Trypanosoma cruzi; Doenças Negligenciadas; Protozoário