Dados do Trabalho

Título

Proteases carreadas por vesículas extracelulares de Acanthamoeba

Introdução

Amebas de vida livre do gênero Acanthamoeba são patógenos oportunistas, capazes de causar infecção cutânea, sistêmica e cerebral, além de afetar a córnea humana, causando ceratite amebiana. No seu ciclo, o protozoário exibe a forma trofozoítica, que se converte em cisto sob condições adversas. Diversas células, incluindo Acanthamoeba, produzem e liberam no meio microestruturas com membrana lipídica denominadas vesículas extracelulares (VEs), que têm papel funcional em processos biológicos. Em continuidade a estudos que mostram que trofozoítos ativos, em condições de abundância nutricional, produzem e liberam VEs contendo proteases, pretende-se investigar se o perfil destas partículas se modifica em função do ciclo celular do protozoário.

Objetivo (s)

Caracterizar comparativamente VEs de Acanthamoeba liberadas por trofozoítos ativos e trofozoítos induzidos ao encistamento. 

Material e Métodos

Trofozoítos de uma cepa de A. castellanii foram cultivados em meio PYG (proteose-peptona extrato de levedo) e usados no estudo. A vesiculação foi realizada com formas previamente lavadas (10^6 /mL) e incubadas em meio RPMI (32°C, 180 rpm) por 2 h ou em salina NEFF para indução de encistamento in vitro. Destas últimas formas, as VEs foram coletadas após 4 h (encistamento precoce) e após 24h (encistamento tardio). Os sobrenadantes filtrados em membrana 0,22 μm foram ultracentrifugados a 100000 x g por 2 horas a 4°C. As VEs foram analisadas por rastreamento de nanopartículas (NTA), avaliadas por microscopia eletrônica de transmissão (MET) e o conteúdo proteico quantificado por método de ácido bicinconínico (BCA). A caracterização parcial de proteases carreadas pelas VEs foi realizada por técnica de zimografia. 

Resultados e Conclusão

As VEs obtidas apresentaram tamanho modal entre 119 nm e 213 nm e concentração de 10^10 a 10^11 partículas/mL e 0,5 μg/μL de proteína. Não houve diferenças significativas entre as amostras de trofozoítos ativos, em encistamento precoce ou encistamento tardio. As análises de MET confirmaram a morfologia das VEs como partículas esféricas delimitadas por camada lipídica. O perfil de proteases das VEs mostrou bandas principais de 35 e 150 kDa, porém com menor intensidade em VEs de formas em encistamento. Estes dados indicam que VEs de Acanthamoeba são produzidas em um perfil físico homogêneo, independente do estímulo ao encistamento, porém a menor atividade proteolítica sugere diferença funcional consistente com a diminuição de metabolismo durante o processo. 

Palavras Chave

Acanthamoeba; vesículas extracelulares; ciclo evolutivo; proteases