Dados do Trabalho

Título

Padronização e validação da técnica de PCR em tempo real com High Resolution Melting para genotipagem de Giardia lamblia

Introdução

 Giardia lamblia é um enteroparasito com distribuição global, de caráter zoonótico, transmissível por via hídrica ou contato direto intra e interespecífico.  A espécie G. lamblia possui um alto potencial zoonótico e é dividida filogeneticamente em genótipos classificados de A a H, de acordo com a especificidade do hospedeiro e características moleculares. atualmente a genotipagem de G. lamblia é feita por sequenciamento gênico que é uma técnica onerosa, e demanda tempo para execução, a qPCR-HRM possui baixo custo e sensibilidade sufiiciente para detectar uma única mudança de nucleotídeo entre sequências análogas. 

Objetivo (s)

Padronizar e validar a técnica de qPCR-HRM para genotipagem de Giardia lamblia encontrados em humanos. 

Material e Métodos

Foi utilizado um banco de amostras armazenadas no  LIPMED. O DNA extraído  com o uso do kit QIAmp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen), foi submetido à PCR e a Nested PCR para amplificação de fragmentos do gene beta-giardina (β- gia), com os primers (G7 e G759). Os fragmentos amplificados pela NESTED PCR foram purificados e o produto  foi submetido ao sequenciamento SANGER e a qPCR-HRM com os primers (β- gia5 e β- gia7-deg) que foram desenhados a fim de obter uma região amplificada de até 120 pares de base flanqueando os trechos onde estão localizados os SNPs que diferenciam os genótipos. 

Resultados e Conclusão

Um total de 76 amostras genotipadas por sequenciamento SANGER, 41 amostras foram agrupadas como genótipo A, 11 amostras como genótipo B e 24 amostras tiveram seu resultado inconclusivo. Na análise pelo qPCR-HRM das mesmas amostras de DNA, 65 foram diferenciadas como genótipo A e 11 como genótipo B. Ao comparamos as duas técnicas, uma amostra divergiu do resultado do sequenciamento, onde agrupava como genótipo B e no qPCR-HRM era diferenciada como genótipo A. A técnica de qPCR-HRM apresentou 98,02% de convergência com o sequenciamento para análise e diferenciação dos genótipos A e B de G. lamblia em amostras clínicas de humanos. Cabe ressaltar que as 24 amostras que tiveram seus resultados inconclusivos por sequenciamento SANGER, na qPCR-HRM 23 amostras foram diferenciadas como genótipo A e uma amostra como genótipo B, o que sugere que o HRM teria uma sensibilidade maior que o sequenciamento de SANGER, para o alvo β-giardina. Neste contexto, a utilização da técnica qPCR-HRM se mostrou uma técnica eficaz para genotipagem de G. lamblia, com potencial de reduzir consideravelmente o tempo de execução e os investimentos financeiros na identificação de genótipos de G. lamblia.   

Palavras Chave

Giardia; qPCR-HRM; genótipos; zoonose.