Dados do Trabalho

Título

ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E PREPARO DE CEPA SELVAGEM DE Leishmania infantum (RRCAN/BR/23/UDIB) PARA ESTUDOS PRÉ-CLÍNICOS DA EFICÁCIA DE FÁRMACOS.

Introdução

A leishmaniose visceral (LV) é uma zoonose endêmica nos trópicos, subtrópicos e na Bacia do Mediterrâneo, causada por protozoários do gênero Leishmania. No Brasil, a principal espécie circulante é a Leishmania infantum, que acomete principalmente humanos e cães, embora outros animais possam atuar como hospedeiros e reservatórios deste parasito. Classificada como uma doença tropical negligenciada, ainda são necessários avanços para que seu controle seja efetivo. Sabe-se que os casos humanos são precedidos por casos caninos em regiões endêmicas e, então, uma possível medida de controle da expansão da LV é a ascensão de um tratamento efetivo para os cães, reservatórios urbanos do parasito.

Objetivo (s)

O objetivo deste trabalho foi isolar uma cepa selvagem de um cão naturalmente infectado com L. infantum, caracterizar a espécie através da técnica de PCR/RFLP e preparar o inóculo para um estudo pré-clínico utilizando o modelo hamster.

Material e Métodos

Foram coletados fragmentos de pele através de punch (5mm) de feridas de um cão infectado município de Belo Horizonte-MG. Essas amostras foram armazenadas em tubos de 1.5mL contendo solução salina, antibiótico e antifúngico e, no laboratório, transferidas para o meio de cultura NNN/LIT a partir do qual, após o crescimento, foram produzidas massas do isolado para a extração de DNA utilizando o kit PureLink Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen®). Em seguida, realizou-se a técnica de PCR/RFLP. Para a PCR convencional foi escolhido o alvo hsp70 e, para a RFLP, a enzima HaeIII. As cepas referências para L. infantum (MHOM/BR/74/PP75), Leishmania braziliensis (MHOM/BR/75/M2903), Leishmania amazonensis (IFLA/BR/67/PH8), Leishmania guyanensis (MHOM/BR/75/M4147) foram utilizadas como controles positivos. Para preparar o inóculo (CEUA Fiocruz: 9/22-6), realizou-se a contagem de promastigotas provenientes da cultura na câmara de Neubauer e, após a diluição em PBS1x, obteve-se uma solução com 26x107 promastigotas/mL. Essa solução foi centrifugada a 2000rpm durante 10 minutos por duas vezes e, depois, houve o descarte do sobrenadante. O conteúdo precipitado foi diluído em 5mL de PBS 1x, obtendo 5x107 parasitos/mL. Foi inoculado 0,2mL em cada animal, o que corresponde a 1x107 promastigotas. 

Resultados e Conclusão

Desta forma, confirmou-se o isolamento da espécie L. infantum de um cão naturalmente infectado. Essa cepa está sendo utilizada para a inoculação em hamsters em um estudo pré-clínico para a avaliar a eficácia de possíveis fármacos para o tratamento da leishmaniose visceral canina.

Palavras Chave

isolamento; cultura; caracterização molecular; estudo pré-clínico; Saúde Única