Dados do Trabalho

Título

Análise comparativa de protocolos para sequenciamento de genoma completo de SARS-CoV-2 utilizando enriquecimento por PCR multiplex

Introdução

Em dezembro de 2019, na China, surgiu o primeiro caso de uma nova doença, identificada posteriormente como COVID-19, causada pelo agente etiológico SARS-CoV-2. Este patógeno se demonstrou altamente contagioso, espalhando-se rapidamente ao redor do mundo, levando a Organização Mundial da Saúde a declarar o estado de pandemia de COVID-19 em março de 2020. Este vírus apresenta um genoma de 29.674 pares de bases e, devido à natureza mutável dos vírus de RNA, surgiram diversas variantes de SARS-CoV-2, classificadas como de interesse ou preocupação devido ao impacto na aptidão viral. A fim de acompanhar a evolução das linhagens, foram desenvolvidos diversos protocolos de sequenciamento do genoma completo de SARS-CoV-2, incluindo técnicas de captura, enriquecimento e amplificação.

Objetivo (s)

Esse estudo propôs comparar a qualidade de genomas obtidos a partir da utilização de três diferentes protocolos de sequenciamento do genoma completo de SARS-CoV-2: CovidSeq, Illumina DNA Prep e Nextera XT, utilizando estratégias de enriquecimento por PCR multiplex a partir da síntese de amplicons curtos (400pb) e amplicons longos (2000pb).

Material e Métodos

O sequenciamento de 21 amostras positivas, com linhagens previamente identificadas, com valores de ct <25, foi iniciado com a  preparação da biblioteca utilizando os três protocolos previamente mencionados. As amostras foram sequenciadas em corridas individuais utilizando a plataforma MIseq Illumina, com capacidade de gerar 8 milhões de reads. As sequências foram geradas a partir do fluxo de análises VirolFlow 1.0, e as métricas de cobertura e profundidade das amostras entre os protocolos foi avaliada.

Resultados e Conclusão

A partir dos resultados obtidos, o protocolo CovidSeq apresentou melhores parâmetros como número de reads por amostra, e permitiu sequenciar e identificar todas as linhagens, enquanto os protocolos Illumina DNA Prep e Nextera XT, conseguiram sequências de 14 e 11 amostras, respectivamente. A média de cobertura dos genomas de SARS-CoV-2 obtidos a partir do sequenciamento utilizando o protocolo CovidSeq varitou entre 91-97% enquanto o Illumina DNA Prep e Nextera XT obtiveram coberturas variando de 1-99% e 1-98% respectivamente. Com isso, o protocolo CovidSeq com utilização de enriquecimento por amplicons curtos se mostrou mais eficaz para o sequenciamento de genomas completos do SARS-CoV-2, independentemente das linhagens, em comparação com os protocolos Illumina DNAPrep e Nextera XT, que utilizaram uma estratégia de amplicons longos.  

Palavras Chave

Sequenciamento de Nova Geração; genoma; cobertura; profundidade.