Dados do Trabalho

Título

Avaliação de ensaios de PCR em tempo real para identificação dos genotipos de Haemophilus influenzae em amostras clínicas

Introdução

Haemophilus influenzae (Hi) é uma bactéria causadora de doenças invasivas graves como meningite e pneumonia e de infecções não invasivas como otite e sinusite. Com a introdução da vacina contra Hi do sorotipo b no Programa Nacional de Imunização se faz necessário o monitoramento dos sorotipos de Hi circulantes no país a fim de verificar se há aumento da frequência de outros sorotipos, ocasionando mudanças no perfil epidemiológico da doença. A identificação molecular dos genotipos de Hi (a, b, c, d, e, f) em amostras clínicas era realizada com uso de seis ensaios de PCR em tempo real (qPCR) em formato individual, demandando alto custo e tempo de trabalho.

Objetivo (s)

O objetivo do presente projeto foi estabelecer, otimizar e avaliar ensaios de qPCR em formato multiplex (mqPCR) para identificação dos genotipos a, b, c, d, e, f de Hi, visando redução de custos, de insumos, de amostras e de recursos humanos, resultando em liberação mais rápida dos resultados.

Material e Métodos

Foram estabelecidos dois ensaios de mqPCR para identificação dos genotipos a, b, d (ensaio abd) e c, e, f (ensaio cef). O limite mínimo de detecção (LMD), linearidade, eficiência e reprodutibilidade foram determinados em três diferentes plataformas de qPCR (Applied Biosystems, Roche e Bio-Rad). Para determinação dos parâmetros de sensibilidade, especificidade e concordância foram utilizadas 162 amostras de DNA extraídas de amostras clínicas, sendo empregados os ensaios de qPCR em formato individual como teste comparativo (CAAE: 49992821.7.0000.0059).

Resultados e Conclusão

O LMD dos ensaios de mqPCR abd e cef foi de 10 cópias por reação para todos os seis alvos genéticos analisados. A eficiência foi de 94,1% a 109,3% e coeficiente de correlação linear (linearidade) de 0,990 a 0,999 nas três plataformas de qPCR. Os ensaios mqPCR mostraram-se reprodutíveis no intraensaio com coeficiente de variação (CV) entre 0,53% e 1,10% e no interensaio com CV entre 0,97% e 2,72%. Em amostras clínicas, os ensaios abc e cef apresentaram sensibilidade, especificidade e concordância de 100% e índice Kappa de 1,00, indicando concordância excelente em relação aos ensaios comparativos em formato individual. Os ensaios de mqPCR abd e cef apresentaram alta sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade para detecção dos genotipos de Hi, representando uma ferramenta importante para caracterização epidemiológica da doença causada por essa bactéria.

Palavras Chave

Haemophilus influenzae; reação em cadeia da polimerase em tempo real; meningites bacterianas; sorotipo