Dados do Trabalho

Título

Análise da técnica Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) e PCR convencional para diagnóstico da leishmaniose visceral canina, em amostras clínicas de cães provenientes de área endêmica no Estado do Rio de Janeiro.

Introdução

A leishmaniose visceral canina (LVC) é uma doença antropozoonótica, negligenciada e de difícil diagnóstico, causada por protozoários do gênero Leishmania. O LAMP é um teste diagnóstico molecular acessível, de baixa complexidade e tempo de execução quando comparado à PCR convencional (cPCR), com resultados promissores para LVC na literatura.

Objetivo (s)

Avaliar os resultados de LAMP e cPCR, frente às técnicas parasitológicas, com diferentes amostras clínicas e métodos de extração de DNA.

Material e Métodos

Este trabalho recebeu dispensa de CEUA por utilizar amostras biológicas de cães de projetos anteriores já aprovados (LW19/20; 071/2015). Como testes de referência foram realizados exames parasitológicos direto e cultura em amostras de medula óssea (MO), linfonodo poplíteo (AL) e baço, e imuno-histoquímica. Foram analisados 54 cães com sorologia reativa para LVC (TR DPP e ELISA). Foram coletadas amostras de swab conjuntival em duplicata (swabs 1 e 2) de ambos os olhos, AL e MO para os testes moleculares. O kit comercial utilizado para extração de DNA dos swabs-1, AL e MO foi kit PureLink™ Genomic DNA, e para swabs-2 foi utilizado método direct-boil/fervura. As amostras foram submetidas à cPCR kDNA-RV1/RV2 e LAMP K26 com mix WarmStart ®Colorimetric LAMP. Para ambas as técnicas moleculares foi utilizado volume final de 25µl, sendo 5µl de DNA. Os controles para as reações foram realizados com cepa de referência de L. infantum e cão sabidamente negativo e saudável. A sensibilidade analítica do LAMP K26 foi analisada através de diluição seriada de L.infantum de 1 nanograma. até 1fentogramag. Os resultados dos ensaios foram inseridos no banco de dados RedCap.

Resultados e Conclusão

Dos 54 cães avaliados, 79% (43/54) foram positivos em pelo menos um dos testes parasitológicos. Em swabs-1, a sensibilidade (S) de cPCR e LAMP foram de 81% e 74%, respectivamente. Em swabs-2, S de cPCR e LAMP foram de 95% e 97%, respectivamente. Em AL, S de cPCR de 80% e LAMP de 82%. Em MO, S de cPCR de 81% e LAMP de 93%. Não houve diferenças estatísticas significativas entre as técnicas, para nenhuma das amostras clínicas. Conclusão: LAMP demonstra resultados promissores para diagnóstico da LVC, com melhor desempenho em swabs-2. Esta foi a primeira avaliação de LAMP-LVC com alvo k26 no Brasil. A extração por fervura associada à amplificação por LAMP pode apresentar um diagnóstico mais acessível e rápido, podendo ser utilizados em laboratórios descentralizados, evidenciando o potencial da técnica e utilização de amostras menos invasivas.

Palavras Chave

Leishmaniose Visceral Canina; PCR convencional; LAMP; diagnóstico; método direct-boil