Dados do Trabalho

Título

USO DA METODOLOGIA DE CRISPR-CAS12 PARA DIAGNÓSTICO DE BACTÉRIAS INFECCIOSAS DE AMBIENTE HOSPITALAR

Introdução

Doenças infecciosas constituem um problema global que impacta bilhões de pessoas. Recentemente, o aumento de patógenos multirresistentes a drogas e aumento nas infecções atreladas a sepse e/ou choque séptico, causadas por bactérias de diversos gêneros, também tem sido alvo de preocupação por estarem fortemente associadas a fatores como morbidade e mortalidade de indivíduos hospitalizados. Nesse cenário, resultados rápidos de testes diagnósticos para adequada terapia com antibióticos são essenciais para reduzir o risco de morte dos pacientes. 

Objetivo (s)

Neste projeto, pretendemos implementar e otimizar a metodologia de CRISPR-Cas12 para diagnóstico molecular laboratorial de infecções causadas por bactérias patogênicas que circulam em ambientes hospitalares, como de Unidade de Terapia Intensiva, para dinamizar, aumentar a sensibilidade e diminuir o tempo do diagnóstico, de quatro espécies de bactérias Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Streptococcus aureus e Streptococcus capitis.

Material e Métodos

Para validação do ensaio de diagnóstico sequências do genoma específicas para cada espécie foram clonadas em um plasmídeo para as etapas subsequentes. Também obtivemos as proteínas Cas12a de três espécies de bactérias, Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCas12a), Francisella tularensis (FnCas12a), Lachnospiraceae bacterium ND2006 (LbCas12a), através de expressão heteróloga utilizando E. coli BL21 (DE3), seguida de purificação com colunas de agarose Ni-NTA. Finalmente, fragmentos de DNA para síntese dos sgRNAs dos diferentes genes alvos foram obtidos através de ensaios de PCR, e transcrição in vitro dos sgRNAs utilizando T7 RNA Polimerase. Nas etapas seguintes, realizamos ensaios de clivagem in vitro com os componentes gerados anteriormente (plasmídeo com gene alvo, enzimas Cas12a e sgRNA específico). As reações foram incubadas a 37º C e monitoradas por um período de 2 horas

Resultados e Conclusão

Verificamos que pelo menos nos experimentos realizados com a LbCas12a conseguimos sucesso na detecção do DNA alvo para A. baumannii, E. coli, S. aureus e S. capitis de maneira específica para cada espécie, como observado no padrão de clivagem do plasmídeo contendo a sequência de cada patógeno. Outros experimentos estão em andamento para validar a atividade de detecção de AsCas12a e FnCas12a.  Os resultados obtidos revelam o potencial da metodologia de CRISPR-Cas12a para a detecção das diferentes bactérias e que, futuramente, pode ser estendida ao diagnóstico de outras doenças infecciosas de importância médica.

Palavras Chave

Bactérias infecciosas; CRISPR; Cas12a; doenças infecciosas; diagnóstico